Tecnologia DNBSEQ™

In cosa si differenzia la tecnologia DNBSEQ™ dai metodi più tradizionali?

Maggiore precisione — Maggiore efficienza

Funzionamento della tecnologia DNBSEQ™ nelle piattaforme di sequenziamento NGS

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Questa tecnologia chiamata DNBSEQ si basa su nanosfere di DNA (DNB). Create durante la preparazione delle librerie, le DNB compatte vengono caricate in celle di flusso e la sequenza viene letta con quattro sonde fluorescenti che riconoscono le quattro basi del DNA. I laser eccitano quindi le sonde mentre vengono acquisite milioni di immagini per identificare le basi. Queste immagini passano attraverso un’analisi delle immagini e successivamente un’analisi bioinformatica per identificare le varianti patogeniche e probabilmente patogeniche riscontrate.

Durante la preparazione della libreria di sequenziamento vengono create molecole di DNA circolare a singolo filamento (ssCirDNA). I tipici frammenti di DNA a doppio filamento, con sequenze adattatrici alle estremità terminali, vengono riscaldati per generare ssDNA. Un oligonucleotide si ibrida a entrambe le estremità del ssDNA per formare cerchi ‘nicked’ mentre una DNA ligasi ripara il ‘nick’ creando cerchi completi a singolo filamento.

Utilizzando il cerchio a singolo filamento, la replicazione a cerchio rotante (RCR) crea miliardi di nanosfere di DNA (DNB) in un’unica provetta. Ogni copia viene realizzata a partire dal cerchio di DNA originale, eliminando gli errori di amplificazione clonale e riducendo i bias del contenuto GC e i dropout tipicamente causati dalla PCR.

 

Le DNB vengono caricate nelle ‘flow cells’, che presentano un array con uno schema di siti di legame di ~200 nm uniformemente spaziati a distanze submicrometriche. Ogni sito lega una singola DNB, garantendo un’elevata produttività di letture accurate con un segnale nitido e senza interferenze dalle DNB adiacenti.

Da qui, la chimica di sintesi combinatoria sonda-ancora (cPAS) ibrida i primer di sequenziamento alle DNB e le sonde marcate con fluorescenza e con terminazione reversibile vengono incorporate da una DNA polimerasi brevettata in cicli di sequenziamento consecutivi. Le sonde fluorescenti vengono quindi eccitate con luce laser e la matrice di DNB viene visualizzata mediante telecamere.