Tecnologia DNBSEQ™
Em que difere a tecnologia DNBSEQ™ dos métodos mais tradicionais?
Maior precisão — Maior eficiência
Funcionamento da tecnologia DNBSEQ™ nas plataformas de sequenciação NGS
Para mais detalhes sobre os dados e resultados da sequenciação, clique aqui.
Esta tecnologia chamada DNBSEQ baseia-se em nanoesferas de ADN (DNB). Criadas durante a preparação das bibliotecas, as DNB compactas são carregadas em células de fluxo e a sequência é lida com quatro sondas fluorescentes que reconhecem as quatro bases do ADN. Os lasers excitam depois as sondas enquanto são captadas milhões de imagens para identificar as bases. Estas imagens passam por uma análise de imagem seguida de uma análise bioinformática para identificar as variantes patogénicas e provavelmente patogénicas encontradas.
Durante a preparação da biblioteca de sequenciação são criadas moléculas de ADN circular de cadeia simples (ssCirDNA). Os fragmentos típicos de ADN de cadeia dupla, com sequências adaptadoras nas extremidades terminais, são aquecidos para gerar ADNcs. Um oligonucleótido hibridiza em ambas as extremidades do ADNcs para formar círculos ‘nicked’ enquanto uma ADN ligase repara o ‘nick’, criando círculos completos de cadeia simples.
Utilizando o círculo de cadeia simples, a replicação em círculo rolante (RCR) cria milhares de milhões de nanoesferas de ADN (DNB) num único tubo. Cada cópia é feita a partir do círculo de ADN original, eliminando os erros de amplificação clonal e reduzindo os vieses de conteúdo GC e as falhas tipicamente causadas pela PCR.
As DNB são carregadas nas ‘flow cells’, que apresentam um array com um padrão de locais de ligação de ~200 nm uniformemente espaçados a distâncias submicrométricas. Cada local liga uma única DNB, garantindo um alto rendimento de leituras precisas com um sinal nítido e sem interferências das DNB adjacentes.
A partir daí, a química de síntese combinatória sonda-âncora (cPAS) hibridiza os primers de sequenciação às DNB, e as sondas marcadas com fluorescência e com terminação reversível são incorporadas por uma ADN polimerase patenteada em ciclos de sequenciação consecutivos. As sondas fluorescentes são depois excitadas com luz laser e a matriz de DNB é visualizada por câmaras.